CRISPR-Cas9, la coupure de l’ADN
Les structures réelles de CRISPR-Cas9, atome par atome, comme dans la vidéo : fais-les tourner et suis Cas9 de la protéine seule jusqu’à la coupure de l’ADN.
Les variables
- L’étape du mécanisme, de la protéine seule à la coupure
- Le point de vue : rotation, zoom, retour au cadrage de la vidéo
- Cas9 pleine, transparente ou masquée, pour voir l’ARN et l’ADN à l’intérieur
- Les noms des domaines et les protéines du décor
Les chiffres clés
- 20 nt
- longueur de l’espaceur de l’ARN guide
- NGG
- PAM reconnu par SpCas9
- 3 pb
- distance entre le PAM et la coupure
- 1 368
- acides aminés dans SpCas9 (≈ 160 kDa)
- 4
- structures réelles de la Protein Data Bank
Ce qui se passe, étape par étape
- 01
Un ARN qui sert de guide
Cas9 est une protéine de la bactérie Streptococcus pyogenes. Seule, elle ne sait pas où couper. Elle porte un ARN guide (chez la bactérie, il est formé de deux ARN ; les chercheurs les ont fusionnés en un seul) dont les 20 premières lettres, l’espaceur, sont choisies par le chercheur : elles reproduisent la séquence d’ADN à viser.
- 02
Le PAM, un laissez-passer
Cas9 ne lit pas tout le génome lettre à lettre. Elle cherche d’abord un court motif, le PAM (NGG pour Cas9 de S. pyogenes), grâce à son domaine PI. Sans PAM juste à côté, même une séquence parfaitement complémentaire est ignorée. C’est aussi ce qui protège la bactérie : dans son propre réseau CRISPR, les espaceurs ne sont pas suivis d’un PAM.
- 03
La boucle R
Une fois le PAM reconnu, Cas9 écarte les deux brins juste à côté. L’ARN guide s’apparie au brin cible, lettre à lettre, en partant du PAM. Le brin non-cible est repoussé : c’est la boucle R. Les 10 à 12 premières paires, la région graine, doivent être parfaites ; une erreur à cet endroit arrête l’ouverture.
- 04
Deux lames, une cassure
Quand l’appariement est complet, le domaine HNH bascule et coupe le brin cible ; le domaine RuvC coupe le brin non-cible. Les deux coupures tombent 3 paires de bases avant le PAM : l’ADN est coupé net, en travers.
- 05
La cellule répare, et c’est là qu’on édite
Cas9 ne modifie rien elle-même : elle casse. La cellule recolle les extrémités. La jonction directe (NHEJ) est souvent exacte, mais Cas9 recoupe tant que la cible est intacte : à force, quelques lettres en plus ou en moins apparaissent, ce qui peut inactiver le gène. Si l’on fournit une matrice d’ADN, la réparation par recombinaison (HDR) peut recopier une séquence choisie.
Ce que la scène simplifie
- Chaque étape est une structure réelle, déterminée séparément. Le passage de l’une à l’autre est un fondu, pas un mouvement calculé.
- L’étape « Coupure » part de la structure de la boucle R (5F9R) : les sites de coupure et le fragment libéré sont placés d’après la littérature.
- Au-delà de l’ADN présent dans le cristal, la double hélice est prolongée par un modèle idéal d’ADN-B.
- Chaque atome est une sphère de van der Waals ; les hydrogènes, absents des structures cristallographiques, ne sont pas représentés.
- Les protéines du décor (nucléosome, hémoglobine, p53, GFP…) sont de vraies structures, placées pour évoquer l’encombrement de la cellule.
- Les couleurs sont des conventions de lisibilité, par domaine de Cas9.
Pour aller plus loin
- Jinek et al., Science 337, 816 (2012)
Cas9 programmable par un ARN guide ; coupure 3 pb en amont du PAM.
- Nishimasu et al., Cell 156, 935 (2014)
Structure cristalline de SpCas9 ; lobes REC et NUC, domaines HNH, RuvC, PI.
- Sternberg et al., Nature 507, 62 (2014)
Recherche de la cible par interrogation des PAM ; région graine.
- Jinek et al., Science 343, 1247997 (2014)
Structure de Cas9 seule (PDB 4CMP).
- Jiang et al., Science 348, 1477 (2015)
Cas9 chargée de son ARN guide (PDB 4ZT0).
- Anders et al., Nature 513, 569 (2014)
Reconnaissance du PAM par le domaine PI (PDB 4UN3).
- Jiang et al., Science 351, 867 (2016)
Structure de la boucle R et mouvement du domaine HNH (PDB 5F9R).
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